세포 냉동 보존에서 Trehalose의 적용에 관한 연구: OPC Cryopreservation

D(+)-트레할로스 이수화물은 안정한 비환원 이당류이다. 극단적 인 열, 추위, 가뭄과 같은 다양한 환경 적 스트레스 하에서 세포 표면에 보호 필름을 형성하여 생물학적 거대 분자의 구조를 손상으로부터 효과적으로 보호 할 수 있습니다. 그것은 생물학적 세포에 대한 우수한 비특이적 보호 기능을 가지고 있으며 가혹한 조건에 대한 생물학적 세포의 내성을 향상시킬 수 있습니다.

최근, D(+)-트레할로스 이수화물은 항체 약물을 포함하는 생물학적 제품에 널리 사용되고 있다. Adcetris, Padcev, Imjudo, Kimmtrak 등과 같은 시판중인 항체 약물 (ADC 포함) 의 약 30% 보호제로 사용됩니다.

D ()-트레할로스 이수화물은 또한 세포 냉동 보존, 보조 생식 및 기타 분야에서 점점 더 중요한 역할을합니다. 여기에서 AVT의 제품 팀은 관련 연구 진행 상황을 이해하는 데 도움이되는 다음 관련 문헌을 해석합니다.

D(+)-OPC의 냉동 보존을위한 트레할로스 이수화물

1. 탈수화 질환을위한 Oligodendrocyte 전구체 세포 (OPC) 의 이식

탈수초성 질환은 척수 손상 (SCI), 다발성 경화증 (MS) 등과 같은 수초의 손실을 특징으로 하는 신경학적 장애이다.

OPC는 성숙한 oligodendrocytes로 분화 할 수 있습니다생체 내중추 신경계의 중요한 골수화 세포이며 신경 축삭을 캡슐화하여 미엘린 구조를 구성합니다. 따라서, OPC의 이식은 탈수초성 질환에 대한 잠재적인 치료법으로 간주된다.

2. OPC의 Cryopreserve를 위한 기존 방법 및 문제점

OPC의 냉동 보존은 인간 OPC의 성공적인 이식에 중요한 단계입니다.

임상적으로 사용되기 전에, 인간 OPC를 100 mL/L DMSO + 900 mL/L FBS의 냉동 보호제로 냉동 보존하였다 (1984 년에 제안된 방법). 70% 에 55% 의 회복 속도. 이 방법은 그 후 오랜 시간 동안 최적화되지 않았다.

DMSO가 세포독성이고 FBS가 면역원성인 것을 고려하면, 상기 저온보존 방법은 임상적 용도에 적합하지 않다.

대규모로 적용 할 수있는보다 경제적이고 효과적이며 안전한 인간 OPC 냉동 보존 방법을 모색하기 위해, southern Medical University의 Liu Chang과 다른 연구자들은 인간 태아 뇌 신경 줄기 세포 (hNSC) 에 의해 유도 된 OPC를 사용하여 위의 방법을 최적화했습니다.

3. OPC의 Cryopreservation 방법의 최적화

① 다른 방법이 OPC의 회수율에 미치는 영향을 비교하면, 소화에 의해 수집된 세포의 생존율이 기계적 피펫팅에 의한 것보다 현저히 높다는 것이 밝혀졌다.

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표 1: 기계적 파괴 및 소화 방법을 사용하여 Cryopreservation 전후의 세포 생존율 및 회수율

④, 인허탈, 자화합 그룹 기계그룹 소화 그룹

A, B Cryoprotectant A Cryoprotectant B

복구 후 Cryopreservation 진동 전의 viability

② 냉동 상자에서 천천히 냉각하고 증기상 액체 질소 탱크에서 빠른 냉각을 통해 4 개의 다른 냉동 보존 매체로 냉동 보존 된 OPC의 회수율을 비교합니다.

이하에 나타낸 바와 같이, 2 개의 냉각 속도에 대한 회수율에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 4 개의 동결보호제의 회수율은 모두 급속 냉각에 의해 30% 미만이었다. D(+)-트레할로스 이수화물을 보충한 냉동 보존 배지 E에 대한 회수율은 냉동 박스에서의 느린 냉각에 의해 가장 높았으며, 이는 (75.73 ± 6.66)% 였다.

③ 냉동 보존 기간이 OPC의 회수율에 미치는 영향 비교

가장 높은 회수율을 가진 냉동 보존 배지 E에서 냉동 보존 된 세포를 후속 실험에서 선택했으며, 회수율은 단기 (<2 개월) 사이에 비교되었습니다. 냉동 보존 및 장기 (6 개월) 냉동 보존으로 두 그룹 간의 회수율에 큰 차이가 없습니다.

④ 세포 증식 활성 비교

세포 증식 비교를 위해 가장 높은 회수율을 갖는 냉동 보존 배지 E를 선택하였다. 평균 증식 배수는 동시에 3 회 연속 통과 후 냉동 보존 배지 E 그룹과 정상 배양 대조군 사이에서 비교되었으며, 두 그룹 사이에는 큰 차이가 없었다. 배양 7 일 후, 정상 배양 그룹과 해동 후 배양 그룹 사이의 증식률에는 유의한 차이가 없었다. 그 결과, OPC의 세포 증식 활성은 동결되지 않은 세포와 필적하는 D(+)-트레할로스 이수화물을 함유하는 냉동 보존 배지로 동결보존된 것으로 나타났다.

결론

이 연구는 소화에 의해 수집 된 hNSC-유도 된 OPC가 70 mL/L DMSO 300 mL/L FBS 0.2 mol/mL D를 함유 한 OPS 완전 배지로 냉동 보존 될 수 있다고 결론지었습니다. (+)-냉동 상자에서 느린 냉각과 빠른 재가열에 의해 오랜 시간 동안 trehalose 이수화물, 평균 회수율은 최대 75% 입니다. 냉동 보존 후 회복은 OPC-특이적 마커 발현 및 증식 능력에 영향을 미치지 않았다.

D ()-trehalose 이수화물은 많은 출처에서 비 독성 세포 막 투과성 냉동 보호제입니다. 이는 hPBSC 및 hESC와 같은 다양한 세포 유형에 대해 우수한 냉동 보존 효과를 갖는 것으로 입증되었다. 이 연구에서, D(+)-트레할로스 이수화물의 낮은 농도로 보충 된 냉동 보존 배지는 모든 실험 그룹에서 가장 높은 회수율을 달성했습니다. 배양 후 증식 및 마커 발현의 결과는 냉동 보존 배지가 D(+) 와 함께 첨가되었음을 나타냅니다.-트레할로스 이수화물은 또한 인간 OPC의 냉동 보존에 적합하고 세포의 회수율을 향상시킬 수 있었다.