세포 냉동 보존에서 Alginate 동결의 전망: Alginate로 인간 전능 줄기 세포를 동결시키는 것

처음 세 가지 문제에서 우리는 인간 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPC), 지방 유래 줄기 세포 (ADSC) 의 냉동 보호에서 D(+)-trehalose 이수 화물에 대한 연구를 공유했습니다. 마우스 고환 생식 세포 등 이 연구는 냉동 보존 배지에 적합한 양의 D(+)-트레할로스 이수화물을 첨가하거나 냉동 보호제 (CPA) 를 사용하는 것으로 나타났습니다. D(+)-트레할로스 이수화물 및 글리세롤을 함유하면 장기간 냉동 보존 후 세포의 회수율을 향상시킬 수 있다.

이 문제에서 우리는 3 개의 다른 인간 다 능성 줄기 세포주에서 D(+)-trehalose 이수화물의 냉동 보호 효과에 대한 명확한 이해를 개발합니다.줄기 세포 연구2018 년 이탈리아 밀라노의 연구원에 의해.

D(+)-트레할로스 이수화물을 가진 인간 전능 줄기 세포의 냉동 보존

소개

줄기 세포를 포함한 세포 치료 제품은 높은 임상 잠재력을 가지고 있습니다. 글로벌 줄기 세포 시장은 상류 및 중류 줄기 세포 저장 및 준비뿐만 아니라 하류 임상 적용을 포함합니다. TMR (Transparency Market Research) 보고서에 따르면 전 세계 줄기 세포 시장은 2025 년 말까지 270.5 억 달러에이를 것으로 예상됩니다. 그리고 시장의 복합 연간 성장률은 지난 8 년 동안 13.8% 도달 할 것입니다.

세포 치료 제품의 성공적인 적용을 보장하기 위해, 세포의 장기 냉동 보존은 동결보존이 세포의 생존력 및 생화학적 기능을 장기간 보존하기 위한 유일한 방법이기 때문에 극복되어야 하는 기술적 어려움이다.

세포 내 동결에 의한 세포 구조의 손상을 피하기 위해 냉동 보호제가 개발되고 판매됩니다. 가장 일반적으로 사용되는 세포 냉동 보호제는 태아 소 혈청 (FBS) 또는 임의의 혈청 대체물과 조합된 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 이다.

그러나 FBS는 알려지지 않은 병원체로 동물성 감염을 일으킬 수있는 이종 성 동물 유래 단백질을 포함합니다. 또한, DMSO는 세포독성이다. 조직 및 세포에 대한 DMSO의 독성은 노출 시간, 온도 및 농도와 직접 관련이 있다고보고되었습니다. 독성의 정도는 세포 유형에 따라 다르며, DMSO를 제거하지 않고 해동 된 세포로 재주입 된 환자에서 부작용이 보고되었다. 또한 DMSO는 3 개의 DNA 메틸 트랜스퍼 라제 (Dnmts) 의 전사 수준을 조절하고 게놈 전체 메틸화 프로파일을 변경함으로써 마우스 배아 체의 후성 유전체에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 이는 차례로 마우스 줄기 세포의 통제되지 않은 분화를 유도한다. 이러한 모든 이유로 DMSO + FBS는 임상 용도에 적합하지 않습니다. 효율적이고 독성이없는 냉동 보호제를 개발할 긴급한 필요성이 있습니다.

D ()-트레할로스 이수화물은 박테리아, 효모, 타디그레이드 및 선충류와 같은 완전한 탈수에서 생존 할 수있는 다양한 유기체에서 발견되는 비 환원 이당류입니다. 포유류는 D(+)-트레할로스 이수화물을 생성하지 않지만, 포유류 세포의 효과적인 냉동 보호제로서, 얼음 결정 형성에 의한 세포 손상을 감소시킬 수 있다. D(+)-트레할로스 이수화물의 보호 효과는 삼투 효과 및 세포막 인지질과 불안정한 단백질의 특정 상호 작용과 관련이 있습니다. 건조와 산화 스트레스로 인한 세포 손상 및 변성을 방지 할 수 있습니다.

비 세포 독성 D(+)-트레할로스 이수화물은 마우스 정자 세포, 성체 조혈 줄기 세포, 중간 엽 줄기 세포와 같은 다양한 유형의 세포의 냉동 보존에 효과적으로 사용되었습니다. 지방 유래 줄기 세포 (ADSCs), 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC). D(+)-트레할로스 이수화물은 제대혈, 골수 및 인간 섬의 냉동 보존에도 사용됩니다.

세포 보존에서 D(+)-트레할로스 이수화물의 광범위한 사용을 막는 주요 장애물은 D(+)-트레할로스 이수화물이 세포의 내부에 접근하기 어렵다는 것이다. 삼투압 쇼크, 리포좀 전달, 열 천공, 전기 천공, 미세 주입 및 유전 공학과 같은 여러 가지 방법이 이전에 적용되었습니다. 그러나, 상기 방법은 복잡한 작업을 필요로 하고, 힘들고 시간 소모적이며, 상당한 세포 손상을 초래할 수 있다.

이 연구에서, 3 가지 상이한 유형의 만능 줄기 세포주를 각각 D(+)-트레할로스 이수화물 단독으로 또는 에틸렌 글리콜 또는 글리세롤과 조합하여 제조된 4 개의 상이한 냉동 보호제로 냉동 보존하였다. 그런 다음 세포주를 해동하여 세포 형태, 해동 후 생존력, 만능 마커 발현 수준, 게놈 안정성, 소포체 (ER) 항상성 및 DNA 손상 반응을 포함한 주요 매개 변수를 조사했습니다. 냉동 보호 캡 측정만능 줄기 세포에 대한 4 개의 냉동 보호제의 투명도.

다른 Cryoprotectant 조성물

모든 냉동 보호제를 새로 제조하고 인산염 완충 식염수 (PBS) 에 희석하였다. 연구에 사용된 세포는 CS10 을 사용하여 냉동 보존하였다. 10% DMSO를 함유 한 CS10 은 혈청 및 동물 성분이없는 냉동 보호제이며, 이는 인간 만능 줄기 세포 (hPSC) 의 냉동 보호에 권장됩니다.

세포의 동결 보존 및 해동

특정 조건 하에서 세포를 배양한다. HESCs-RC17 0.5 mM EDTA로 분리하고, hiPSCs-CTR2 #6 및 ltNES-AF22 세포 분리 용액으로 처리하고, 새로 제조된 냉동 보호제 (A, B, C 및 D) 에 저장한다. 2.0 × 10 ^ 6 개의 세포를 각각의 극저온 보호제 1.5 mL에 소생시키고 극저온 바이알로 옮긴다.

냉동 용기에 있는 극저온 바이알을 약-1 ℃/분으로 식히고, 밤새 보관 후-80 ℃에서 냉동실로 옮긴다. 24 시간 후, 적어도 1 주일 동안 저장을 위해 극저온 바이알을 액체 질소로 옮긴다.

얼음 덩어리가 사라질 때까지 37 ℃의 수조에서 극저온 바이알을 데우고 따뜻한 매질로 세포 현탁액을 희석합니다. 3 분 동안 원심분리에 의해 조직 200 g의 세포를 수집하고, 표시된 접종 크기의 각 세포 유형에 적합한 코팅된 배양 용기 상에 시드한다.

결과 및 토론

① 세포 생존력

해동 후 48 h 제제로 세포 생존율을 측정한다.

먼저, D(+)-트레할로스 이수화물, 에틸렌 글리콜 및 글리세롤의 적절한 양을 결정하기 위해, 상이한 농도의 단일 성분 용액을 상이한 줄기 세포주에 사용하였다. 해동 후 세포의 생존력을 측정하고 대조군과 비교하였다. 결과는 0.5 M D(+)-트레할로스 이수화물, 10% 에틸렌 글리콜 및 10% 글리세롤이 적절한 양이지만, 상이한 줄기 세포 유형간에 큰 차이가 있음을 보여주었다.

초기 농도를 결정한 후, 4 개의 상이한 냉동 보호제 (상기 참조) 를 사용하여 3 개의 줄기 세포주: (그룹 A) hESCs-RC17, (그룹 B) hiPSCs-CTR2 #6, 및 (그룹 C) ltNES-AF22. 해동 후 세포의 생존력을 측정하였다. 세포 생존율은 또한 동일한 조건 하에서 CS10 에서 동결보존된 동일한 세포와 비교되었다.

세포가 D(+)-트레할로스 이수화물 (그룹 A) 만으로 냉동 보존되었을 때, 해동 후 세포의 회수율은 감소하여 상이한 세포 유형에 대해 20% 내지 60% 변화하였다.

D(+)-트레할로스 이수화물 기반 배지에 10% 에틸렌 글리콜 또는 10% 글리세롤 (그룹 C 및 D) 이 보충되었을 때, hESCs-RC17 및 ltNES-AF22 세포 생존율은 DMSO에서 동결보존된 것과 유사한 수준에 도달하였다. 그러나, 글리세롤에서 동결보존된 hiPSCs-CTR2 #6 의 세포 생존율은 에틸렌 글리콜의 세포 생존율보다 우수하였다.

또한, 결과를 에틸렌 글리콜 또는 글리세롤을 단독으로 함유하는 대조군 냉동 보호제와 비교하여, 증가 된 생존율은 에틸렌 글리콜/글리세롤 + D(+) 의 결합 효과 때문인 것으로 확인되었습니다.-트레할로스 이수화물.

이러한 결과는 D(+)-트레할로스 이수화물이 인간 만능 줄기 세포의 냉동 보존에 사용될 수 있으며 DMSO를 대체 할 것으로 예상됩니다. 10% 에틸렌 글리콜 또는 10% 글리세롤을 첨가하면 트레할로스 냉동 보호제의 생존율을 크게 향상시킬 수 있습니다. 평균 세포 생존율은 CS10 에 비해 증가하였다. 에틸렌 글리콜/글리세롤 및 D(+)-트레할로스 이수화물의 냉동 보호제는 혈청 단백질을 함유하지 않으며, 만능 줄기 세포의 조기 분화를 자극하는 이전에 보고된 위험을 피한다.

② 세포 형태

에 대한 또 다른 관심사줄기 세포 냉동 보존은 염색체 및 만능 변형입니다. 동결 및 해동 중에 얼음 결정과 거품이 세포 내부와 외부에 형성되어 스핀들 미세 소관을 방해하여 비정상적인 염색체 분리를 유도하고 세포 성장 특성 및 형태를 변화시킬 수 있습니다. 따라서, 해동 후 세포의 형태를 관찰함으로써, 염색체에 대한 손상 가능성 및 줄기 세포의 만능 전위를 쉽게 평가할 수 있다.

상부 그림은 해동 후 #6 및 ltNES-AF22 48 hiPSCs-CTR2 hESCs-RC17 세포 형태를 나타낸다. 상 대비 이미지는 복합 D( )-트레할로스 이수화물 냉동 보호제가 어떤 세포주에서도 상당한 형태 학적 변화를 일으키지 않았으며 세포 형태는 CS10 에 보존 된 세포의 형태와 동일하다는 것을 보여주었습니다.

③ 마커 표현 수준

해동 후 hESCs-RC17, #6 hiPSCs-CTR2 및 ltNES-AF22 다능성 줄기 세포의 주요 특성 및 특성을 유지함을 확인하기 위해, 해동 후 48 시간 동안 정량적 RT-PCR 여러 마커의 발현 수준을 분석하였다.

세포 마커 Nanog, Oct4 및 Sox2 는 hESCs-RC17 및 hiPSCs-CTR2 #6 에 대해 검출되었고, 대조군과 비교되었다.

Nestin 및 Sox2 는 ltNES-AF22 대해 검출되었고 대조군과 비교되었습니다. 결과는 줄기 세포 분화 잠재력이 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.

④ 염색체 안정성

줄기 세포의 염색체 안정성에 대한 D( )-트레할로스 이수화물 기반 냉동 보호제의 효과를 평가하기 위해, 종래의 핵형 및 aCGH를 3 가지 줄기 세포주 모두에서 수행하였다. 아래 그림은 냉동 보존 전후의 ltNES-AF22 결과를 보여줍니다.

전체적으로, 핵형은 안정하게 유지되었지만, 카피수 변이 (CNV) 가 검출되었다 (염색체 2, 8, 19 및 22). CNV 중 일부는 1 차 세포에 존재할 수 있고, 다른 것들은 냉동 보존보다는 세포의 시험관 내 조작 중에 무작위로 발생했을 수 있다. 클론 이배수성 또는 구조적 염색체 수차가 (도 C) 전에 및 (도 D) 냉동 보존 전에 관찰되지 않았기 때문에.

⑤ ER 스트레스/펼쳐진 단백질 수준 평가

이 연구는 또한 CS10 또는 D( )-트레할로스 이수화물의 냉동 보존이 소포체 (ER) 스트레스에 반응하고 접히지 않은 단백질 반응 (UPR) 을 활성화하는 만능 세포의 능력에 영향을 미치는지에 초점을 맞추 었습니다. 상이한 생리학적 또는 병리학적 조건에서 항상성을 유지하기 위해, ER은 다양한 분자 및 세포 신호를 통합한다. ER 스트레스와 UPR 모두 세포 증식, 분화 및 세포 사멸에 영향을 미치는 분자 및 생화학 적 메커니즘을 매개합니다.

전체적으로, D( )-트레할로스 이수화물은 CS10 에 비해 적당한 수준의 ER 응력/UPR을 나타내었다. 유일하게 더 민감한 세포주는 hiPSCs-CTR2 #6 이었고, 이는 그룹 B와 C에서 더 높은 BIP 및 CHOP 유전자 발현 수준을 보였으며, 이는 D( ) 를 사용한 냉동 보존을 나타냅니다.-트레할로스 이수화물은 CS10 에 비해 다능성 줄기 세포의 ER 항상성을 크게 변화시키지 않았다.

결론

줄기 세포의 장기 냉동 보존은 세포 이식 및 세포 요법과 같은 많은 분야에서 큰 적용 잠재력을 가지고 있습니다. 여러 연구에서 인간 만능 줄기 세포의 냉동 보존 수단을 최적화했으며 D( )-트레할로스 이수화물을 사용한 장기 냉동 보존이 이상적인 방법이 될 수 있습니다.

D( )-트레할로스 이수화물 냉동 보호제에 보존 된 인간 다 능성 줄기 세포는 세포 표현형 및 기능적 특성을 유지하여 임상 치료에서 D( )-트레할로스 이수 화물의 잠재적 적용을 나타냅니다. 복합 D( )-트레할로스 이수화물 냉동 보호제로 냉동 보존 된 세포의 생물 안전성, D( )-트레할로스 이수화물과 에틸렌 글리콜 또는 글리세롤의 조합, 세포 독성 또는 동물 유래 단백질이없는 생물 안전 냉동 보호제로서 임상 용도에 대한 큰 가능성을 보여줍니다.