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역상 크로마토그래피에서, 이동상의 pH는 일반적으로 2-7 사이이다. 분석물이 역상 조건에서 해리 할 수 있거나 샘플의 pH가 2-7 범위 밖에있을 때완충액 소금필요합니다. 역상 조건 하에서 해리될 수 있는 화합물은 일반적으로 아미노 및 카르복실기를 가지며, pKa 값은 1-11 이다. 정확한 완충 pH를 선택하는 것은 해리된 작용기가 이온성 형태 또는 중성 화합물 형태로 존재하는 것을 보장할 수 있다. 샘플의 pH가 컬럼에 유해한 경우 완충 용액으로 인해 완화가 이루어지거나 해를 줄일 수 있습니다. 종래의 실리카계 컬럼에 대한 pH 허용 범위는 2-8 이다. 일반적인 완충 전해질염은 다음과 같이 분류된다.
1. 알칼리성완충액 염
일반적인 첨가제는 암모니아 및 트리에틸아민을 포함하며, 이들 둘 다 물의 pH를 매우 높은 수준으로 증가시킬 수 있고, 실리카겔 입자를 용해시키기에 충분히 높다. 따라서 조심스럽게 사용해야합니다. 또한, 이들 2 개의 용매는 일반적으로 세척 및 유지 방법을 통해 쉽게 제거되지 않는다. 특히 트리에틸아민의 경우, 크로마토그래피적 순도인 경우라도, 장기간 저장 후 열화로 인해 오염될 수 있다.
2. 산성완충액 염
1. 포름산: 보통 1% 이하의 농도로 사용되며, 물의 pH를 약 2 로 증가시킬 수 있습니다.
2. 아세트산: 포름산보다 약간 덜 산성이며, 보통 5% 초과하지 않는 농도로 사용되며, 물의 pH를 약 2 로 증가시킬 수 있습니다.
3. Trifluoroacetic 산: 일반적으로 0.5% 초과하지 않는 농도로 사용되는 비교적 강한 산으로 물의 pH를 2 이하로 낮출 수 있습니다. 이온 강도가 크고 특정 이온 쌍 효과가 있으며 단백질과 펩타이드를 분석 할 때 첨가제로 자주 사용됩니다. 이 세 가지 산의 가장 치명적인 문제는 낮은 파장에서 UV 흡수에 있습니다. 일반적으로 215nm 미만의 파장에서는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 또한 포름산, 아세트산 및 트리플루오로아세트산은 휘발성이며 이들의 농도완충 전해질 염시간이 지남에 따라 변경 될 수 있습니다.
4. 인산: 이것은 이온 강도가 좋은 비 휘발성 산입니다. 가장 중요한 것은 저 파장 UV 영역에서 배경 흡수가 없다는 것입니다. 그러나 질량 분석 방법과 호환되지 않는 것과 같은 몇 가지 단점이 있습니다. 또한 황산, 염산 또는 시트르산과 같은 다른 산이 있지만 드물다.
3. 소금완충액 염
다른 두 염의 비율을 조정하여 간단한 산-염기 완충제와 비교완충액 염특정 pH를 갖는 완충 용액을 용이하게 제조할 수 있고, 완충 능력을 갖는 완충 염은 이동상의 pH 값을 제어할 수 있다.
1. 포름산 염: 액체 크로마토그래피에서 일반적으로 사용되는 포름산 염은 암모늄 포름산염이다. 이 유형의 염은 용해도가 좋고 액체 질량 분석법과 완전히 호환되며 크로마토 그래피 컬럼에 상대적으로 작은 영향을 미칩니다. 그러나, 단점은 이온 강도가 비교적 낮다는 것이다. 또한, 포름산 염은 소멸되기 쉽기 때문에 이동 단계에서 중량이 어렵고 잠재적으로 휘발성이 있습니다. 포름산과 조합될 때, 포름산-암모늄 포름산염 완충 시스템은 단지 2 개의 비율을 조정함으로써 3 ~ 4.5 의 pH 범위 내에서 완충 능력을 달성할 수 있다.
2. 아세테이트 염: 일반적인 예는 암모늄 아세테이트입니다. 아세테이트 염의 사용은 포르메이트 염과 유사하며 이온 강도는 높지 않습니다. 아세트산-암모늄 아세테이트 완충 시스템은 pH를 4 ~ 5.5 범위로 조절할 수 있다.
3. 인산염 염: 220 nm 미만의 파장에서 사용할 수 있기 때문에 UV 검출 조건 하에서 HPLC에서 가장 일반적으로 사용되는 완충 용액 중 하나입니다. 인산염 염은 3 개의 pKa 값을 갖는다. 이들이 널리 사용되지만, 고농도 조건하에서 HPLC 펌프 또는 크로마토그래피 컬럼에서 침전되는 것을 방지하기 위해 그들의 용해도 문제에주의를 기울여야 한다.
인산의 나트륨 및 칼륨 염이 일반적으로 사용되며, 이 둘의 pH 제어 능력은 매우 유사하며 이온 강도에 약간의 차이가 있습니다. 대부분의 경우 상호 교환 가능하게 사용할 수 있습니다. 인산은 다염기산이기 때문에 인산수소 및 인산이이수소를 형성 할 수 있습니다. 따라서 인산염 완충 시스템을 사용하여 pH를 조정하면보다 유연하고 넓은 범위를 커버 할 수 있으며 높은 이온 강도를 제공 할 수 있습니다. 불행히도, 이동상을위한 인산염 완충 시스템은 호환되지 않습니다.질량 분석법을 가진 le.
