세포 냉동 보존에 Trehalose 적용: 마우스 고환 세균 세포의 냉동 보존

이전 두 문제에서 우리는 인간 유래 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPC) 의 냉동 보존을위한 D(+)-trehalose 이수화물 사용에 대한 관련 연구를 공유했습니다. 및 지방 유래 줄기 세포 (ADSCs). 이러한 연구에 따르면 일정량의 D ()-트레할로스 이수화물을 냉동 보존 매체에 추가하거나 D () 의 복합 냉동 보호제를 사용하는 것으로 나타났습니다.-트레할로스 이수화물 글리세롤은 장기 냉동 보존 후 줄기 세포의 회복 속도를 개선하여 질병 치료 또는 상처 복구를위한 줄기 세포의 후속 임상 적용에 기여할 수 있습니다.

이 문제에서, 우리는 보조 생식 분야에서 D(+)-트레할로스 이수화물의 적용 전망을 탐구하기 위해 마우스 고환 생식 세포의 냉동 보존을 예로 든다.

미성숙 한 마우스에서 고환 세균 세포의 냉동 보존에 대한 다양한 냉동 보호제의 효과

고환 세균 세포의 냉동 보존 배경

최근 몇 년 동안 보조 생식 기술의 급속한 발전으로 점점 더 많은 불임 남성이 자손을 낳을 수있게되었습니다. 이 과정에서 재생 관련 세포의 장기 냉동 보존은 성공률에 영향을 미치는 주요 기술적 어려움 중 하나가되었습니다.

예를 들어, 사춘기 전 남성 암 환자의 경우 생식선 독성 치료는 영구적 인 생식력 상실로 이어질 수 있습니다. 저온에서 고환 조직 또는 세포의 장기간 냉동 보존은 생식력을 보존하는 중요한 수단입니다.

그러나 전신 종양 환자의 경우 해동 후 냉동 보존 된 고환 조직의자가 이식은 암 세포의 재 도입 위험이 있습니다. 암세포가 고환 세포 현탁액으로부터 분리될 수 있고 정자 줄기세포 (SSC) 가 시험관 내에서 배양되어 둥근 정자 분화를 유도할 수 있다는 점을 고려하면, 자손을 낳는 것은 둥근 정자 주사로 얻을 수 있습니다.

따라서 암에 걸린 사춘기 전 남성 환자의 경우 고환 생식 세포의 장기 냉동 보존은 남성 생식력을 보존하는 핵심 방법 중 하나이며 잠재적 인 임상 적용 가치가 있습니다.

허난성 인민 병원의 장 샤오 롱과 다른 연구자들은 사춘기 이전에 인간 미성숙 고환 조직의 발달 상태를 시뮬레이션하기 위해 2 주 된 쥐를 사용했습니다. 최고의 냉동 보존 방법을 탐구하기 위해 마우스 고환 생식 세포를 동결시키기 위해 다양한 냉동 보존 프로토콜을 채택했습니다.

다른 Cryoprotants의 효과 비교

이 연구에서 냉동 보존 배지는 다른 구성 요소에 따라 다음 5 그룹으로 나누어졌습니다.

마우스 고환 생식 세포 현탁액을 2 단계 효소 가수분해에 의해 제조하고, 분배하고, 각각 5 개의 상이한 냉동 보호제를 첨가한 후 극저온 바이알로 옮겼다. 극저온 바이알은 프로그램 된 동결, 2 개월 후 액체 질소 탱크에서 꺼내어 세포 생존율, 세포 사멸 속도 및 미토콘드리아 막 전위를 검출하기 위해 회수되었습니다.

연구 결과

① 극저온 보존 전후의 세포 생존율 및 회수율

냉동 보존 전과 비교하여, 냉동 보존 후 세포 생존율은 5 개 시험 그룹 모두에서 감소하였다. 이들 중, 그룹 E에서의 세포 생존율 및 회수율은 다른 4 개 시험 그룹보다 유의하게 높았다.

② 냉동 보존 후 세포 회복

각 그룹에서, 냉동 보존 후 고환 생식 세포의 회수율은 해동 후 4 mg의 해리 및 냉동 보존 된 고환 조직으로부터 실제로 회수 된 생존 세포의 수를 기준으로 정량적으로 평가되었다. 결과는 그룹 E에서 회수된 세포의 수가 다른 4 개의 시험 그룹에서의 세포보다 유의하게 더 높다는 것을 보여주었다.

③ 자멸률

세포 사멸 속도는 각 그룹에서 유세포 분석 (FC) 에 의해 검출되었다. 결과는 아폽토시스율이 대조군과 비교하여 각각의 시험 그룹에서 유의하게 증가되었음을 보여주었다. 5 개의 시험 그룹에서, 그룹 E에서의 세포자멸률은 다른 4 개의 시험 그룹에서의 세포자멸률보다 상당히 낮았다.

④ 미토콘드리아 막 전위

대조군과 비교할 때, 냉동 보존 된 세포의 미토콘드리아 막 전위는 5 개 시험 그룹에서 해동 후 크게 감소했으며, 그룹 E에서 가장 작은 감소, 이는 다른 4 개의 테스트 그룹보다 상당히 낮았다.

토론회

동결보호제는 투과성 및 불투과성으로 분류될 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 불투과성 냉동 보호제는 수크로스와 D ()-트레할로스 이수화물이다. 이전 연구에 따르면 냉동 보호제에 수크로스 또는 D ()-트레할로스 이수화물을 첨가하면 붉은 털 원숭이 또는 생쥐에서 고환 생식 세포의 회복 속도가 크게 증가 할 수 있음을 확인했습니다.

위의 연구 결과는 냉동 보호제에 0.1 mol/L 수크로스 또는 0.1 mol/L D ()-trehalose 이수화물을 첨가하면 세포 냉동 보존에 특정 보호 효과가 있음을 보여주었습니다. 0.1 mol/L 수크로스와 0.1 mol/L D ()-trehalose 이수화물을 동시에 첨가하면 해동 후 냉동 보존 된 마우스 고환 생식 세포의 회수율이 크게 증가했습니다. 세포 사멸 속도를 감소시키고, 냉동 보존으로 인한 미토콘드리아 막 전위의 손상을 감소시켰다.

그러나, 더 높은 DMSO 농도 (15%) 에 의해 야기된 세포독성은 수크로스와 D(+)-트레할로스 이수화물의 극저온 보호 효과를 부분적으로 상쇄한다.